Réaction en chaîne par polymérase

Réaction en chaîne par polymérase

Concept
Informations
Terme anglais	Biochimie, réaction en chaîne par polymérase (PCR)
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Introduction

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) fait référence à une technique largement utilisée en sciences fondamentales et biomédicales. La PCR est une technique de laboratoire utilisée pour amplifier des segments spécifiques d'ADN pour un large éventail d'applications en recherche et/ou en cliniques. Le laboratoire de Kary Mullis a développé cette technique au début des années 1980, après avoir remporté un prix Nobel une décennie plus tard. Cette technique est devenu un instrument incontournable dans de nombreuses applications, notamment le clonage de gènes, le diagnostic des maladies infectieuses et le dépistage des anomalies génétiques délétères chez les nourrissons prénatals.

Fondamentaux

Les principaux composants de la PCR sont une matrice, des amorces, des bases nucléotidiques libres et l'enzyme ADN polymérase. Le modèle d'ADN contient la région spécifique que vous souhaitez amplifier, comme l'ADN extrait d'un morceau de cheveux par exemple. Les amorces, ou oligonucléotides, sont de courts brins d'ADN complémentaires de l'extrémité 3 'de chaque région cible. Une amorce directe et une amorce inverse sont nécessaires, une pour chaque brin complémentaire d'ADN. L'ADN polymérase est l'enzyme qui effectue la réplication de l'ADN. Les analogues thermostables de l'ADN polymérase I, comme la Taq polymérase, qui a été trouvée à l'origine dans une bactérie qui se développe dans les sources chaudes, est un choix courant en raison de sa résistance aux cycles de chauffage et de refroidissement nécessaires à la PCR.

La PCR tire parti de l'appariement de bases complémentaires, de la nature double brin et de la température de fusion des molécules d'ADN. Ce processus implique le cycle à travers 3 cycles séquentiels de réactions dépendantes de la température: fusion de l'ADN (dénaturation), recuit et réplication de l'ADN pilotée par les enzymes (allongement). La dénaturation commence par chauffer la réaction à environ 95 ° C, interrompant les liaisons hydrogène qui maintiennent les deux brins d'ADN matrice ensemble. Ensuite, la réaction est réduite à environ 50 à 65 C, selon les variables physico-chimiques des amorces, permettant le recuit de paires de bases complémentaires. Les amorces, qui sont ajoutées à la solution en excès, se lient au début du 3 ' fin de chaque brin de modèle et empêcher la ré-hybridation du brin de modèle avec lui-même. Enfin, la réplication de l'ADN pilotée par les enzymes commence par régler la température de réaction à la quantité qui optimise l'activité de l'ADN polymérase, qui est d'environ 75 à 80 C. À ce stade, l'ADN polymérase, qui a besoin d'ADN double brin pour commencer la réplication, synthétise un nouveau brin d'ADN en assemblant des nucléotides libres en solution dans le sens 3 'à 5' pour produire 2 ensembles complets de brins complémentaires. L'ADN nouvellement synthétisé est désormais identique au brin de matrice et sera utilisé tel quel dans les cycles de PCR progressifs.

Étant donné que les brins d'ADN précédemment synthétisés servent de modèles, l'amplification de l'ADN à l'aide de la PCR augmente à un taux exponentiel, où les copies d'ADN doublent à la fin de chaque étape de réplication. La réplication exponentielle de l'ADN cible finit par atteindre des plateaux d'environ 30 à 40 cycles, principalement en raison de la limitation des réactifs, mais peut également être due aux inhibiteurs de la réaction de polymérase trouvés dans l'échantillon, à l'auto-recuit du produit accumulé et à l'accumulation de molécules de pyrophosphate.

PCR en temps réel

À son arrivée, la technologie de la PCR était limitée à une analyse qualitative et / ou semi-quantitative en raison des limites de la capacité de quantifier les acides nucléiques. À ce moment, pour vérifier si le gène cible a été amplifié avec succès, l'ADN produit a été séparé par taille par électrophorèse sur gel d'agarose. Le bromure d'éthidium, une molécule qui émet une fluorescence lorsqu'elle est liée à l'ADNdb, pourrait donner une estimation approximative de la quantité d'ADN en comparant grossièrement la brillance des bandes séparées, mais n'était pas assez sensible pour une analyse quantitative rigoureuse.

Des améliorations dans le développement et l'instrumentation des fluorophores ont conduit à des thermocycleurs qui ne nécessitaient plus la mesure de l'ADN du produit final uniquement. Ce processus, connu sous le nom de PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR), a permis de détecter l'ADNdb pendant l'amplification. Les thermocycleurs qPCR sont équipés de la capacité d'exciter les fluorophores à des longueurs d'onde spécifiques, de détecter leur émission avec un photodétecteur et d'enregistrer les valeurs. La collecte sensible de valeurs numériques lors de l'amplification a fortement amélioré la puissance analytique quantitative.

Il existe deux principaux types de fluorophores utilisés dans qPCR: ceux qui se lient spécifiquement à une séquence cible donnée et ceux qui ne le font pas. La sensibilité des fluorophores a été un aspect important du développement de qPCR. L'un des marqueurs non spécifiques les plus efficaces et les plus largement utilisés, le SYBR Green, après avoir été lié à la petite rainure de l'ADNdb, présente une augmentation de 1000 fois de la fluorescence par rapport au fait d'être libre en solution. Cependant, si encore plus de spécificité est souhaitée, un oligonucléotide spécifique à la séquence, ou une sonde d'hybridation, peut être ajouté, qui se lie au gène cible à un moment donné devant l'amorce (après l'extrémité 3 '). Ces sondes d'hybridation contiennent une molécule rapporteur à l'extrémité 5 'et une molécule d'extinction à l'extrémité 3'. La molécule d'extincteur inhibe efficacement le reporter de la fluorescence pendant que la sonde est intacte. Cependant, au contact de l'ADN polymérase I, la sonde d'hybridation est clivée, ce qui permet la fluorescence du colorant.

PCR à transcription inverse

Depuis son avènement, la technologie PCR a été développée de manière créative et la PCR à transcription inverse (RT-PCR) est l'une des avancées les plus importantes. La PCR en temps réel est souvent confondue avec la PCR à transcription inverse, mais ce sont des techniques distinctes. En RT-PCR, l'ADN amplifié est dérivé de l'ARNm en utilisant des enzymes de transcriptase inverse, des ADN polymérases exprimées par des rétrovirus contenant de l'ARN, pour générer une bibliothèque d'ADN complémentaire (ADNc). En utilisant des séquences d'amorces pour les gènes d'intérêt, les méthodes traditionnelles de PCR peuvent être utilisées avec l'ADNc pour étudier qualitativement l'expression des gènes. Actuellement, la PCR à transcription inverse est couramment utilisée avec la PCR en temps réel, ce qui permet de mesurer quantitativement le changement relatif de l'expression des gènes à travers différents échantillons.

Sujets de préoccupation

Un inconvénient de la technologie PCR est qu'elle est extrêmement sensible. Des traces de contamination par l'ARN ou l'ADN dans l'échantillon peuvent produire des résultats extrêmement trompeurs. Un autre inconvénient est que les amorces conçues pour la PCR nécessitent des données de séquence et ne peuvent donc être utilisées que pour identifier la présence ou l'absence d'un pathogène ou d'un gène connu. Une autre limitation est que, parfois, les amorces utilisées pour la PCR peuvent s'hybrider de manière non spécifique à des séquences similaires, mais non identiques, au gène cible.

Un autre problème potentiel de l'utilisation de la PCR est la possibilité de formation de dimère d'amorce (PD). PD est un sous-produit potentiel et se compose de molécules d'amorces qui se sont hybridées les unes aux autres en raison des chaînes de bases complémentaires dans les amorces. L'ADN polymérase amplifie la PD, ce qui entraîne une concurrence pour les réactifs de PCR qui pourraient être utilisés pour amplifier les séquences cibles.

Importance clinique

L'amplification par PCR est un outil indispensable avec diverses applications en médecine. Souvent, il est utilisé pour tester la présence d'allèles spécifiques, comme dans le cas de futurs parents qui recherchent des porteurs génétiques, mais il peut également être utilisé pour diagnostiquer la présence de maladie directement et pour des mutations dans l'embryon en développement. Par exemple, la première fois que la PCR a été utilisée de cette manière était pour le diagnostic de l'anémie falciforme grâce à la détection d'une mutation génique unique.

De plus, la PCR a considérablement révolutionné le potentiel de diagnostic des maladies infectieuses, car elle peut être utilisée pour déterminer rapidement l'identité de microbes qui étaient traditionnellement incapables d'être cultivés, ou qui nécessitaient des semaines pour leur croissance. virus de l'immunodéficience humaine, virus de l'herpès simplex, syphilis et d'innombrables autres agents pathogènes. De plus, le qPCR est non seulement utilisé pour tester la présence qualitative de microbes, mais aussi pour quantifier les charges bactériennes, fongiques et virales.

La sensibilité des outils de diagnostic des mutations aux oncogènes et aux gènes de suppression tumorale a été améliorée d'au moins 10 000 fois grâce à la PCR, permettant un diagnostic plus précoce des cancers comme la leucémie. La PCR a également permis des thérapies plus nuancées et individualisées pour les patients cancéreux. De plus, la PCR peut être utilisée pour le typage tissulaire essentiel à l'implantation d'organe et a même été proposée en remplacement des tests basés sur les anticorps pour le groupe sanguin. La PCR a également des applications cliniques dans le domaine des tests prénatals pour diverses maladies génétiques et / ou pathologies cliniques. Les échantillons sont obtenus soit par amniocentèse, soit par prélèvement de villosités choriales.

En médecine légale, de courts morceaux d'ADN hautement polymorphe répétitif, de courts répétitions en tandem (STR), sont amplifiés et utilisés pour comparer des variations spécifiques au sein des gènes afin de différencier les individus. . Divers loci contiennent des STR dans le génome humain, et la puissance statistique de cette technique est améliorée en vérifiant plusieurs sites.

Références

• Cette page a été modifiée ou créée le 2020/07/12 à partir de Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR) (StatPearls / Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR) (2018/12/10)), écrite par les contributeurs de StatPearls et partagée sous la licence CC-BY 4.0 international (jusqu'au 2022-12-08). Le contenu original est disponible à https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30571074 (livre).

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