Réaction en chaîne par polymérase

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Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
Concept
Informations
Terme anglais Polymerase chain reaction
Wikidata ID Q176996
Spécialités Biochimie, Infectiologie, Médecine génétique

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1 Introduction[modifier | w]

La réaction en chaîne par polymérase (PCR en anglais) fait référence à une technique largement utilisée en sciences fondamentales et biomédicales. La PCR est une technique de laboratoire utilisée pour amplifier des segments spécifiques d'ADN pour un large éventail d'applications en recherche et/ou en clinique. Le laboratoire de Kary Mullis a développé cette technique au début des années 1980, après avoir remporté un prix Nobel une décennie plus tard. Cette technique est devenue un instrument incontournable pour de nombreuses applications, notamment le clonage de gènes, le diagnostic des maladies infectieuses et le dépistage des anomalies génétiques délétères chez les nourrissons prénatals.

2 Principe[modifier | w]

Les principaux composants de la réaction PCR sont une matrice (l'ADN), des amorces, des bases nucléiques libres (dNTP) et l'enzyme ADN polymérase.

  • La matrice d'ADN contient la région spécifique que vous souhaitez amplifier, comme l'ADN extrait d'un morceau de cheveux par exemple.
  • Les amorces, ou oligonucléotides, sont de courts brins d'ADN complémentaires pouvant s'hybrider de part et d'autre de la région d'ADN d'intérêt. Deux amorces par réaction sont nécessaires, soit une amorce directe et une amorce inverse, c'est-à-dire une pour chaque brin complémentaire de l'ADN.
  • L'ADN polymérase est l'enzyme qui effectue la réplication de l'ADN. Les analogues thermostables de l'ADN polymérase I, comme la Taq polymérase, qui a été découverte chez une bactérie qui se développe dans les sources chaudes, est un choix courant en raison de sa résistance aux cycles de chauffage et de refroidissement nécessaires à la PCR.[1]

La PCR tire parti de l'appariement de bases complémentaires des amorces sur l'ADN, de la nature double brin et de la température de fusion des molécules d'ADN. Ce processus implique une série de cycles à travers trois étapes séquentiels de réactions dépendantes de la température : dénaturation de l'ADN, l'appariement des amorces sur l'ADN et la réaction de polymérisation de l'ADN par l'ADN polymérase (élongation).

  1. La première étape débute par la dénaturation de l'ADN à environ 95°C (Figure 1A), ce qui permet de fournir l'énergie nécessaire à la rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent les deux brins d'ADN ensemble.
  2. Ensuite, la température de la réaction est diminué à environ 50 à 65°C, selon les variables physico-chimiques des amorces, permettant l'appariement de paires de bases complémentaires (Figure 1B).[2]
  3. Enfin, la réplication de l'ADN par l'enzyme ADN polymérase est la dernière étape où la température de la réaction est d'environ 72°C (Figure 1C). À ce stade, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN en assemblant à la chaine les nucléotides libres en solution dans le sens 3' à 5' pour produire deux ensembles complets de brins complémentaires. L'ADN nouvellement synthétisé est désormais identique au brin de la matrice et sera utilisé tel quel dans les cycles de PCR subséquents.

Étant donné que les brins d'ADN précédemment synthétisés servent de matrice, l'amplification de l'ADN à l'aide de la PCR augmente à un taux exponentiel, où les copies d'ADN doublent à la fin de chaque étape de réplication. La réplication exponentielle de la région de l'ADN finit par atteindre des plateaux d'environ 30 à 40 cycles, principalement en raison de la limitation des réactifs, mais peut également être due aux inhibiteurs de la réaction de polymérase trouvés dans l'échantillon et à l'accumulation de molécules de pyrophosphate. [3]

A) Dénaturation : Cette étape est le premier cycle de la PCR et elle consiste à chauffer la réaction pendant environ 20 secondes. Ce chauffage permet de rompre les liaisons hydrogènes entre les deux brins de l’ADN, ce qui permet sa dénaturation en deux molécules d’ADN simples brins. B) Appariement : Dans cette étape, la température de réaction est abaissée à 50–62°C pendant environ 10 secondes, ce qui permet l’hybridation des amorces à chacun des ADN simples brins. Deux amorces différentes sont nécessaires dans le mélange réactionnel: une pour chacun des deux brins complémentaires. C) Élongation : Dernière étape du cycle PCR, l’ADN polymérase synthétise un nouveau brin d’ADN complémentaire au brin matrice d’ADN en ajoutant des nucléotides libres qui sont complémentaires à la matrice dans la direction 3’ à 5’ à une température d’environ 72°C. Après chaque cycle, les brins nouvellement générés deviennent des brins de matrice pour le prochain cycle d’élongation, conduisant à une amplification exponentielle (géométrique) de la région cible d’ADN spécifique.

2.1 PCR en temps réel[modifier | w]

À son arrivée, la technologie de la PCR était limitée à une analyse qualitative et/ou semi-quantitative en raison des limites de la capacité à quantifier les acides nucléiques. À ce moment, pour vérifier si le gène cible a été amplifié avec succès, le produit de la réaction est déposé sur un gel d'agarose puis séparé par électrophorèse selon la taille. Le bromure d'éthidium, une agent intercalant de l'ADN double brin qui émet une fluorescence lorsqu'elle est liée à ce dernier, pourrait donner une estimation approximative de la quantité d'ADN en comparant grossièrement la brillance des bandes séparées. Cependant, cette méthode n'est pas assez sensible pour une analyse quantitative rigoureuse.

Des améliorations dans le développement et l'instrumentation des fluorophores ont permis d'obtenir des thermocycleurs qui permettent la quantification absolue ou relative de l'ADN. Ce processus, connu sous le nom de PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR), a permis de quantifier l'ADNdb pendant l'amplification. Les thermocycleurs qPCR sont équipés de la capacité d'exciter les fluorophores à des longueurs d'onde spécifiques, de détecter leur émission avec un photodétecteur et d'enregistrer les valeurs. La collecte sensible de valeurs numériques lors de l'amplification a fortement amélioré la puissance analytique quantitative.

Il existe deux principaux types de fluorophores utilisés dans le qPCR: ceux qui se lient spécifiquement à une séquence cible donnée et ceux qui ne le font pas. La sensibilité des fluorophores a été un aspect important du développement du qPCR. L'un des marqueurs non spécifiques les plus efficaces et les plus largement utilisés est le SYBR Green. Après avoir été lié à le petite sillon de l'ADNdb, le SYBR green présente une augmentation de 1000 fois sa fluorescence par rapport au fait d'être libre en solution. Cependant, si encore plus de spécificité est souhaitée, un oligonucléotide spécifique à la séquence, ou une sonde d'hybridation, peut être ajouté. En effet, celui-ci se lie au gène cible à un moment donné devant l'amorce, plus précisément après l'extrémité 3'. Ces sondes d'hybridation contiennent une molécule rapporteur à l'extrémité 5' et une molécule d'extinction (quencher) à l'extrémité 3'. La molécule d'extincteur inhibe efficacement le reporter de la fluorescence pendant que la sonde est intacte. Cependant, au contact de l'ADN polymérase I, la sonde d'hybridation est clivée, ce qui permet la fluorescence du colorant.

2.2 PCR à transcription inverse[modifier | w]

Depuis son avènement, la technologie PCR a été développée de manière créative et la PCR à transcription inverse (RT-PCR) est l'une des avancées les plus importantes. La PCR en temps réel est souvent confondue avec la PCR à transcription inverse, mais ce sont des techniques distinctes. En RT-PCR, l'ADN amplifié est dérivé de l'ARNm en utilisant des enzymes de transcriptase inverse, des ADN polymérases exprimées par des rétrovirus contenant de l'ARN, pour générer une bibliothèque d'ADN complémentaire (ADNc). En utilisant des séquences d'amorces pour les gènes d'intérêt, les méthodes traditionnelles de PCR peuvent être utilisées avec l'ADNc pour étudier qualitativement l'expression des gènes. Actuellement, la PCR à transcription inverse est couramment utilisée avec la PCR en temps réel, ce qui permet de mesurer quantitativement le changement relatif de l'expression des gènes à travers différents échantillons.

3 Limitations de la technique[modifier | w]

Une limitation de la technologie PCR est qu'elle est extrêmement sensible. Des traces de contamination par ARN ou ADN dans l'échantillon peuvent produire des résultats extrêmement trompeurs. Un autre inconvénient est que les amorces conçues pour la PCR nécessitent des données de séquence et ne peuvent donc être utilisées que pour identifier la présence ou l'absence d'un pathogène ou d'un gène connu. Une autre limitation est que, parfois, les amorces utilisées pour la PCR peuvent s'hybrider de manière non spécifique à des séquences similaires, mais non identiques, à la région cible. C'est donc pourquoi, il est nécessaire de toujours vérifier que la réaction PCR et qPCR n'a qu'amplifier qu'un seul amplicon et ce, respectivement, via une migration sur gel d'agarose du produit de la réaction et via la courbe de dissociation. [4]

Un autre problème potentiel de l'utilisation de la PCR est la possibilité de formation de dimère d'amorce. Ceci est un sous-produit potentiel et se compose de molécules d'amorce qui se sont hybridées les unes aux autres en raison des chaînes de bases complémentaires dans les amorces. L'ADN polymérase amplifie le dimère, ce qui entraîne une compétition pour les réactifs du PCR qui pourraient être utilisés pour amplifier les séquences cibles.[5] Enfin, les régions à amplifier riche en G-C peuvent aussi causer certains problèmes. En effet, les trois liaisons hydrogènes entre la cytosine (C) et la guanine (G), et la présence de structures secondaires peuvent nuire à l'efficacité de l'ADN polymérase. Pour ce faire, certains additifs peuvent être ajoutés, comme le diméthyle sulfoxide (DMSO).[6]

4 Importance clinique[modifier | w]

L'amplification par PCR est un outil indispensable avec diverses applications en médecine. Souvent, il est utilisé pour tester la présence d'allèles spécifiques, comme dans le cas de futurs parents qui recherchent s'ils sont porteurs de certaines maladies génétiques. Il peut également être utilisé pour diagnostiquer la présence de maladie et pour déterminer la présence de mutations chez l'embryon en développement. Par exemple, la première fois que la PCR a été utilisée de cette manière était pour le diagnostic de l'anémie falciforme grâce à la détection d'une mutation génique unique.[7]

De plus, la PCR a considérablement révolutionné le potentiel de diagnostic des maladies infectieuses, car elle peut être utilisée pour déterminer rapidement l'identité de microbes qui étaient traditionnellement incapables d'être cultivés ou qui nécessitaient des semaines pour leur croissance, comme le virus de l'immunodéficience humaine, le virus de l'herpès simplex, la syphilis et d'innombrables autres agents pathogènes.[8] De plus, le qPCR est non seulement utilisé pour tester la présence qualitative de microbes, mais aussi pour quantifier les charges bactériennes, fongiques et virales.[9]

La sensibilité des outils de diagnostic des mutations aux oncogènes et aux gènes de suppression tumorale a été grandement améliorée grâce à la PCR, permettant un diagnostic plus précoce des cancers, comme la leucémie. La PCR a également permis des thérapies plus nuancées et individualisées pour les patients cancéreux. De plus, elle peut être utilisée pour déterminer le type tissulaire essentiel lors de l'implantation d'organe et a même été proposée en remplacement des tests basés sur les anticorps pour le groupe sanguin. La PCR a également des applications cliniques dans le domaine des tests prénataux pour diverses maladies génétiques et/ou pathologiques.

En médecine légale, de courts morceaux d'ADN hautement polymorphe répétitif et de courts répétitions en tandem (STR) sont amplifiés et utilisés pour comparer des variations spécifiques au sein des gènes afin de différencier les individus. [10] Divers loci contiennent des STR dans le génome humain et la puissance statistique de cette technique est améliorée en vérifiant plusieurs sites.

5 Références[modifier | w]

  1. K. B. Mullis, « The unusual origin of the polymerase chain reaction », Scientific American, vol. 262, no 4,‎ , p. 56–61, 64–65 (ISSN 0036-8733, PMID 2315679, DOI 10.1038/scientificamerican0490-56, lire en ligne)
  2. Carl T. Wittwer, Mark G. Herrmann, Alan A. Moss et Randy P. Rasmussen, « Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. 1997 », BioTechniques, vol. 54, no 6,‎ , p. 314–320 (ISSN 1940-9818, PMID 23905170, DOI 10.2144/000114043, lire en ligne)
  3. Faoud T. Ishmael et Cristiana Stellato, « Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician », Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology, vol. 101, no 4,‎ , p. 437–443 (ISSN 1081-1206, PMID 18939735, DOI 10.1016/S1081-1206(10)60323-7, lire en ligne)
  4. Cindy J. Smith et A. Mark Osborn, « Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology », FEMS microbiology ecology, vol. 67, no 1,‎ , p. 6–20 (ISSN 0168-6496, PMID 19120456, DOI 10.1111/j.1574-6941.2008.00629.x, lire en ligne)
  5. J. Brownie, S. Shawcross, J. Theaker et D. Whitcombe, « The elimination of primer-dimer accumulation in PCR », Nucleic Acids Research, vol. 25, no 16,‎ , p. 3235–3241 (ISSN 0305-1048, PMID 9241236, DOI 10.1093/nar/25.16.3235, lire en ligne)
  6. (en) Michael A. Jensen, Marilyn Fukushima et Ronald W. Davis, « DMSO and Betaine Greatly Improve Amplification of GC-Rich Constructs in De Novo Synthesis », PLoS ONE, vol. 5, no 6,‎ , e11024 (ISSN 1932-6203, PMID 20552011, Central PMCID PMC2883997, DOI 10.1371/journal.pone.0011024, lire en ligne)
  7. R. K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona et K. B. Mullis, « Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 1985 », Biotechnology (Reading, Mass.), vol. 24,‎ , p. 476–480 (ISSN 0740-7378, PMID 1422056, lire en ligne)
  8. I. M. Mackay, « Real-time PCR in the microbiology laboratory », Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, vol. 10, no 3,‎ , p. 190–212 (ISSN 1198-743X, PMID 15008940, DOI 10.1111/j.1198-743x.2004.00722.x, lire en ligne)
  9. Kenneth L. Muldrew, « Molecular diagnostics of infectious diseases », Current Opinion in Pediatrics, vol. 21, no 1,‎ , p. 102–111 (ISSN 1531-698X, PMID 19242246, DOI 10.1097/MOP.0b013e328320d87e, lire en ligne)
  10. (en) Keiji Tamaki et Alec J. Jeffreys, « Human tandem repeat sequences in forensic DNA typing », Legal Medicine, vol. 7, no 4,‎ , p. 244–250 (DOI 10.1016/j.legalmed.2005.02.002, lire en ligne)

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