Réaction en chaîne par polymérase

Réaction en chaîne par polymérase

Concept
Informations
Terme anglais	Biochimie, réaction en chaîne par polymérase (PCR)
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Introduction

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) fait référence à une technique largement utilisée en sciences fondamentales et biomédicales. La PCR est une technique de laboratoire utilisée pour amplifier des segments spécifiques d'ADN pour un large éventail d'applications en recherche et/ou en cliniques. Le laboratoire de Kary Mullis a développé cette technique au début des années 1980, après avoir remporté un prix Nobel une décennie plus tard. Cette technique est devenu un instrument incontournable dans de nombreuses applications, notamment le clonage de gènes, le diagnostic des maladies infectieuses et le dépistage des anomalies génétiques délétères chez les nourrissons prénatals.

Principe

Les principaux composants de la réaction PCR sont une matrice (l'ADN), des amorces, des bases nucléiques libres (dNTP) et l'enzyme ADN polymérase. La matrice d'ADN contient la région spécifique que vous souhaitez amplifier, comme l'ADN extrait d'un morceau de cheveux par exemple. Les amorces, ou oligonucléotides, sont de courts brins d'ADN complémentaires pouvant s'hybrider de part et d'autre de la région d'ADN d'intérêt. Deux amorces par réaction sont nécessaire, soit une amorce directe et une amorce inverse, c'est-è-dre une pour chaque brin complémentaire de l'ADN. L'ADN polymérase est l'enzyme qui effectue la réplication de l'ADN. Les analogues thermostables de l'ADN polymérase I, comme la Taq polymérase, qui a été découverte chez une bactérie qui se développe dans les sources chaudes, est un choix courant en raison de sa résistance aux cycles de chauffage et de refroidissement nécessaires à la PCR.

La PCR tire parti de l'appariement de bases complémentaires des amorces sur l'ADN, de la nature double brin et de la température de fusion des molécules d'ADN. Ce processus implique une série de cycles à travers 3 étapes séquentiels de réactions dépendantes de la température: dénaturation de l'ADN, l'appariement des amorces sur l'ADN et la réaction de polymérisation de l'ADN par l'ADN polymérase (élongation). La première étape débute par la dénaturation de l'ADN à environ 95°C (FIGURE), ce qui permet de fournir l'énergie nécessaire à la rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent les deux brins d'ADN ensemble. Ensuite, la température de la réaction est diminué à environ 50 à 65°C, selon les variables physico-chimiques des amorces, permettant l'appariement de paires de bases complémentaires (FIGURE). Enfin, la réplication de l'ADN par l'enzyme ADN polymérase est la dernière étape où la température de la réaction est d'environ 72°C (FIGURE). À ce stade, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN en assemblant à la chaine les nucléotides libres en solution dans le sens 3' à 5' pour produire deux ensembles complets de brins complémentaires. L'ADN nouvellement synthétisé est désormais identique au brin de la matrice et sera utilisé tel quel dans les cycles de PCR subséquents.

Étant donné que les brins d'ADN précédemment synthétisés servent de matrice, l'amplification de l'ADN à l'aide de la PCR augmente à un taux exponentiel, où les copies d'ADN doublent à la fin de chaque étape de réplication. La réplication exponentielle de la région de l'ADN finit par atteindre des plateaux d'environ 30 à 40 cycles, principalement en raison de la limitation des réactifs, mais peut également être due aux inhibiteurs de la réaction de polymérase trouvés dans l'échantillon et à l'accumulation de molécules de pyrophosphate.

AJOUTER UNE FIGURE***

PCR en temps réel

À son arrivée, la technologie de la PCR était limitée à une analyse qualitative et/ou semi-quantitative en raison des limites de la capacité à quantifier les acides nucléiques. À ce moment, pour vérifier si le gène cible a été amplifié avec succès, le produit de la réaction est déposé sur un gel d'agarose puis séparé par électrophorèse selon la taille. Le bromure d'éthidium, une agent intercalant de l'ADN double brin qui émet une fluorescence lorsqu'elle est liée à ce dernier, pourrait donner une estimation approximative de la quantité d'ADN en comparant grossièrement la brillance des bandes séparées. Cependant, cette méthode n'est pas assez sensible pour une analyse quantitative rigoureuse.

Des améliorations dans le développement et l'instrumentation des fluorophores ont permis d'obtenir des thermocycleurs qui permettent la quantification absolue ou relative de l'ADN. Ce processus, connu sous le nom de PCR en temps réel ou PCR quantitative (qPCR), a permis de quantifier l'ADNdb pendant l'amplification. Les thermocycleurs qPCR sont équipés de la capacité d'exciter les fluorophores à des longueurs d'onde spécifiques, de détecter leur émission avec un photodétecteur et d'enregistrer les valeurs. La collecte sensible de valeurs numériques lors de l'amplification a fortement amélioré la puissance analytique quantitative.

Il existe deux principaux types de fluorophores utilisés dans le qPCR: ceux qui se lient spécifiquement à une séquence cible donnée et ceux qui ne le font pas. La sensibilité des fluorophores a été un aspect important du développement du qPCR. L'un des marqueurs non spécifiques les plus efficaces et les plus largement utilisés est le SYBR Green. Après avoir été lié à le petite sillon de l'ADNdb, le SYBR green présente une augmentation de 1000 fois sa fluorescence par rapport au fait d'être libre en solution. Cependant, si encore plus de spécificité est souhaitée, un oligonucléotide spécifique à la séquence, ou une sonde d'hybridation, peut être ajouté. En effet, celui-ci se lie au gène cible à un moment donné devant l'amorce, plus précisément après l'extrémité 3'. Ces sondes d'hybridation contiennent une molécule rapporteur à l'extrémité 5' et une molécule d'extinction (quencher) à l'extrémité 3'. La molécule d'extincteur inhibe efficacement le reporter de la fluorescence pendant que la sonde est intacte. Cependant, au contact de l'ADN polymérase I, la sonde d'hybridation est clivée, ce qui permet la fluorescence du colorant.

PCR à transcription inverse

Depuis son avènement, la technologie PCR a été développée de manière créative et la PCR à transcription inverse (RT-PCR) est l'une des avancées les plus importantes. La PCR en temps réel est souvent confondue avec la PCR à transcription inverse, mais ce sont des techniques distinctes. En RT-PCR, l'ADN amplifié est dérivé de l'ARNm en utilisant des enzymes de transcriptase inverse, des ADN polymérases exprimées par des rétrovirus contenant de l'ARN, pour générer une bibliothèque d'ADN complémentaire (ADNc). En utilisant des séquences d'amorces pour les gènes d'intérêt, les méthodes traditionnelles de PCR peuvent être utilisées avec l'ADNc pour étudier qualitativement l'expression des gènes. Actuellement, la PCR à transcription inverse est couramment utilisée avec la PCR en temps réel, ce qui permet de mesurer quantitativement le changement relatif de l'expression des gènes à travers différents échantillons.

Limitations de la technique

Une limitation de la technologie PCR est qu'elle est extrêmement sensible. Des traces de contamination par ARN ou ADN dans l'échantillon peuvent produire des résultats extrêmement trompeurs. Un autre inconvénient est que les amorces conçues pour la PCR nécessitent des données de séquence et ne peuvent donc être utilisées que pour identifier la présence ou l'absence d'un pathogène ou d'un gène connu. Une autre limitation est que, parfois, les amorces utilisées pour la PCR peuvent s'hybrider de manière non spécifique à des séquences similaires, mais non identiques, à la région cible. C'est donc pourquoi, il est nécessaire de toujours vérifier que la réaction PCR et qPCR n'a qu'amplifier qu'un seul amplicon et ce, respectivement, via une migration sur gel d'agarose du produit de la réaction et via la courbe de dissociation.

Un autre problème potentiel de l'utilisation de la PCR est la possibilité de formation de dimère d'amorce. Ceci est un sous-produit potentiel et se compose de molécules d'amorce qui se sont hybridées les unes aux autres en raison des chaînes de bases complémentaires dans les amorces. L'ADN polymérase amplifie le dimère, ce qui entraîne une compétition pour les réactifs du PCR qui pourraient être utilisés pour amplifier les séquences cibles. Enfin, les régions à amplifier riche en G-C peuvent aussi causer certains problèmes. En effet, les trois liaisons hydrogènes entre la cytosine (C) et la guanine (G), et la présence de structures secondaires peuvent nuire à l'efficacité de l'ADN polymérase. Pour ce faire, certains additifs peuvent être ajoutés, comme le diméthyle sulfoxide (DMSO).

Importance clinique

L'amplification par PCR est un outil indispensable avec diverses applications en médecine. Souvent, il est utilisé pour tester la présence d'allèles spécifiques, comme dans le cas de futurs parents qui recherchent des porteurs génétiques, mais il peut également être utilisé pour diagnostiquer la présence de maladie directement et pour des mutations dans l'embryon en développement. Par exemple, la première fois que la PCR a été utilisée de cette manière était pour le diagnostic de l'anémie falciforme grâce à la détection d'une mutation génique unique.

De plus, la PCR a considérablement révolutionné le potentiel de diagnostic des maladies infectieuses, car elle peut être utilisée pour déterminer rapidement l'identité de microbes qui étaient traditionnellement incapables d'être cultivés, ou qui nécessitaient des semaines pour leur croissance. virus de l'immunodéficience humaine, virus de l'herpès simplex, syphilis et d'innombrables autres agents pathogènes. De plus, le qPCR est non seulement utilisé pour tester la présence qualitative de microbes, mais aussi pour quantifier les charges bactériennes, fongiques et virales.

La sensibilité des outils de diagnostic des mutations aux oncogènes et aux gènes de suppression tumorale a été améliorée d'au moins 10 000 fois grâce à la PCR, permettant un diagnostic plus précoce des cancers comme la leucémie. La PCR a également permis des thérapies plus nuancées et individualisées pour les patients cancéreux. De plus, la PCR peut être utilisée pour le typage tissulaire essentiel à l'implantation d'organe et a même été proposée en remplacement des tests basés sur les anticorps pour le groupe sanguin. La PCR a également des applications cliniques dans le domaine des tests prénatals pour diverses maladies génétiques et / ou pathologies cliniques. Les échantillons sont obtenus soit par amniocentèse, soit par prélèvement de villosités choriales.

En médecine légale, de courts morceaux d'ADN hautement polymorphe répétitif, de courts répétitions en tandem (STR), sont amplifiés et utilisés pour comparer des variations spécifiques au sein des gènes afin de différencier les individus. . Divers loci contiennent des STR dans le génome humain, et la puissance statistique de cette technique est améliorée en vérifiant plusieurs sites.

Références

• Cette page a été modifiée ou créée le 2020/07/12 à partir de Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR) (StatPearls / Biochemistry, Polymerase Chain Reaction (PCR) (2018/12/10)), écrite par les contributeurs de StatPearls et partagée sous la licence CC-BY 4.0 international (jusqu'au 2022-12-08). Le contenu original est disponible à https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30571074 (livre).

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