ULaval:MED-1206/Microbiologie et infectiologie/Diagnostic de laboratoire des infections

L'examen direct en microbiologie

Pourquoi faire ce tests?

Quantifier les GB présents dans le prélèvement : nous informe sur la réponse inflammatoire et la purulence de l’échantillon
Dans certains cas, exprimer en valeur relative la quantité de polynucléaires présents dans le prélèvement (Ex : Liquide céphalo-rachidien)
Observation de micro-organismes
- Bactéries
- Éléments mycéliens (champignons)
- Levure
- Structures parasitaires
- Inclusions virales
Évaluation de la qualité du prélèvement pour décider si le résultat final sera fiable

Examens directs

Sérum physiologique	• Permet d’observer la mobilité de certains micro-organismes • Permet d’évaluer rapidement les micro-organismes avec des formes particulières (levures)
Hydroxyde de potassium (KOH)	• KOH 10% digère la kératine • Utile pour diagnostiquer des éléments mycéliens (champignons) à partir de prélèvement d’ongles, de peau ou de cheveux
Iode	• Colore les noyaux et organelles cytoplasmiques • Utile pour colorer rapidement les selles d’un patient et diagnostiquer la présence de protozoaires
Encre de Chine	• Met en évidence la capsule entourant certains micro-organismes • Moins utilisée depuis l’avènement des tests antigéniques
Fond noir	Utile pour mettre en évidence des micro-organismes mal visualisés en microscopie optique standards et qui se colore difficilement

Examens directs avec coloration

Coloration Gram

Principe	Technique	Interprétation	Utilités
La teneur en lipide de la paroi cellulaire des bactéries est variable. Gram + : Paroi pauvre en lipide, donc violet Gram - : Paroi riche en lipide donc rose	Prélèvement sur lame Fixer avec chaleur Cristal violet (1min) Laver Iode (1min) pour fixer le cristal violet Décolorer à acétone alcool Laver Safranine (1min) Laver, assécher Lire au microscope	Couleur mauve: Cristal violet non décoloré par acétone alcool : safranine est inefficace, donc paroi pauvre en lipides Couleur rose : Paroi riche en lipides, donc cristal violet libéré facilement par le décolorant. La safranine est possible	Reconnaitre rapidement le/les bactéries pathogènes présentes dans le prélèvement et d’en informer le clinicien. Évalue la présence/absence de flore normale si provient d’un site non stérile. Évalue la réponse inflammatoire, car les GB sont colorés. Permet de quantifier de façon relative les polynucléaires vs. cellules mononuclées. Aide à distinguer les infections bactériennes et virales.

Coloration Ziehl-Neelson

Principe	Technique	Interprétation	Utilités
Paroi épaisse et cireuse ne se colorant pas facilement. Une fois les parois colorées, elles résistent à la décoloration par un solvant. Ce sont des bacilles acido-alcoolo résistants (BAAR)	Préparer une lame à partir du prélèvement comme la coloration « Carbol fuchsin » Laver Acide-alcool Laver Bleu de méthylène Laver, assécher Lire au microscope	Couleur bleue: Paroi mince, moins imperméable, a pris le « Carbol fuchsin » (rose) mais n’a pas résisté au décolorant, donc le bleu de méthylène a contre-coloré. Ce n’est pas un BAAR (négatif). Couleur rose : Paroi épaisse et cireuse capte le « carbol fuchsin » et résiste au bleu de méthylène. Lac couleur finale est rose et c’est un BAAR (positif).	Identification présomptive des mycobactéries sans identifier l’espèce D’autres fermes sont des BAAR

Interpréter les résultats de la culture d'un spécimen clinique

Caractéristiques macroscopiques

Forme de la colonie
Couleur de la colonie
Grosseur de la colonie
Présence ou non d’hémolysine autour de la colonie

Identification préliminaire selon la macroscopique

Staphylocoque: Grosse colonie convexe, jaune, hémolyse bêta

Streptocoque : Petite colonie convexe, translucide, hémolyse bêta large

Pneumocoque : Colonie plate, ombiliquée, translucide, hémolyse alpha

Entérobactérie : Colonie surélevée, semi-opaque, grise

Pseudomonas : Colonie plate opaque, verdâtre, odeur fruitée

Identification finale

Performance de tests biochimiques à partir des colonies
Rapport partiel
Identification finale de la bactérie
Performance de l’antibiogramme
Émission du rapport final

Interprétation des résultats

Prélèvement à partir d’un site normalement stérile

Le sang et tous les liquides biologiques tels :

Liquide céphalo-rachidien
Liquide synovial
Liquide pleural

Sont normalement stériles. Quand un ou plusieurs germes sont identifiés à partir de ce type de prélèvement, il faut toujours lire les rapports attentivement.

Lorsqu’un pathogène classiquement associé à une infection d’un liquide normalement stérile est mis en évidence, le médecin qui prend connaissance du rapport considère que l’infection suspectée ou non est confirmée.

Liquide céphalo-rachidien : Méningocoque
Liquide synovial: S. aureus
Liquide pleural: Pneumocoque

Prélèvement à partir d’un site non stérile

On entend par site non stérile un site où il est connu qu’une flore normale s’y retrouve. Ex :

Bouche
Vagin
Peau
Rectum ou selles

Pour bien interpréter les résultats de cultures obtenus à partir des sites non stériles, il faut :

Connaitre la flore normale de ces sites
Porter attention seulement aux bactéries qui ne font pas partie de cette flore ou qui sont reconnues pour causer des infections.

Différents types de diagnostic rapide

Détection rapide d'antigènes

Diverses méthodes existent sur une base commerciale pour détecter rapidement la présence d’antigènes (souvent des protéines de surface) caractéristique de certains micro-organismes. D’autres tests rapides sont disponibles pour identifier en quelques minutes la présence d’influenza de type A à partir d’échantillon respiratoire.

Méthode moléculaire

Ces méthodes consistent à amplifierune partie du génome à identifier dans un premier temps (amplifier = générer de multiples copies d’une portion du génome). Par la suite, il suffit d’appliquer une méthode de détection de la portion du génome maintenant amplifiée pour confirmer la présence d’un pathogène suspecté.

Ces méthodes sont utiles quand le germe à détecter se cultive difficilement ou qui se trouve en faible quantité dans un prélèvement donné, ce qui rend sa détection difficile.

C’est le cas de l’herpès simplex qui peut causer des encéphalites. Le recherche d’herpès par culture standard s’avère souvent infructueuse à partir d’un prélèvement de liquide céphalorachidien. Par contre, l’application d’une méthode d’amplification de type PCR à partir du même liquide céphalorachidien révèle habituellement la présence d’herpès simplex.

Utilisation des sérologies

La sérologie met en évidence des preuves indirectes de la présence d’un agent infectieux. Au lieu de détecter le germe directement, on détecte la présence d’anticorps spécifiquesproduits par le patient colonisé ou infecté par un germe. Ces anticorps produits par le SI sont présents dans le sérum.

Utilité

La recherche d’anticorps est utile pour diagnostiquer des infections virales, les virus étant généralement plus longs et difficiles à mettre en évidence par culture.

Types d'anticorps recherchés

Les deux types d’anticorps utilisés en microbiologie diagnostique sont :


Anticorps de type M ou IgM	Anticorps de type G ou IgG
En phase aiguë Indique une infection actuelle ou très récente Quand la phase aiguë est passée, ce type d’anticorps disparait et des IgG apparaissent	En phase de convalescence Confère une immunité long terme contre l’agent infectieux en question Au début d’une infection, les IgG sont absentes. Quand un deuxième sérum est prélevé au moins 2 semaines plus tard, la présence d’IgG spécifiques à l’infection en cause est documentée. Le passage des IgG négatif à positif est appelé « séroconversion ». Ce principe s’applique à la vaccination : la recherche d’anticorps est effectuée sur un premier échantillon prélevé quelques semaines post-vaccination.